可熒光定量活細胞的脂肪酸β-氧化活性試劑

可熒光定量活細胞的脂肪酸β-氧化（FAO）活性的試劑

FAOBlue

FAOBlue是一款可以通過藍色熒光可視化脂肪酸分解的共同途徑——脂肪酸β-氧化（FAO）的活性的試劑。

通過熒光成像，可以簡單地檢測出過去難以檢測的活細胞中的脂肪酸β-氧化活性。

該產(chǎn)品可廣泛應用于對比評估不同細胞種類之間的β-氧化，探索促進或抑制β-氧化活性的化合物，β-氧化相關(guān)酶群的基礎研究等領(lǐng)域。

※　本產(chǎn)品基于九州大學研究生院藥學研究院藥物發(fā)現(xiàn)化學生物學領(lǐng)域 王子田彰夫教授的研究成果，

※　由Funakoshi株式會社商品化并銷售。

※　本產(chǎn)品僅供研究使用。

使用FAOBlue可視化HepG2細胞的FAO活性

添加FAOBlue到HepG2細胞中，觀察活細胞成像，可從細胞中觀察到藍色熒光。另一方面，若使用FAO抑制劑進行前處理，則熒光強度明顯減少，由此可知，藍色熒光的強度取決于FAO的活性。

◆何為脂肪酸β-氧化（Fatty acid beta-oxidation; FAO）

脂肪酸是構(gòu)成細胞的各種脂質(zhì)的基本要素，與葡萄糖、氨基酸并稱為能源。尤其是在葡萄糖不足而饑餓的時候，脂肪酸會分解活躍，產(chǎn)生大量的ATP。雖然脂肪酸根據(jù)碳鏈的長短以及不飽和度的差別而存在不同的種類，但是由于它的分解屬于線粒體等細胞器的共同分解途徑，因此這種途徑被統(tǒng)稱為脂肪酸β-氧化（Fatty acid beta-oxidation; FAO）。

脂肪酸β-氧化主要通過4步酶反應——1）脂肪酸β位的氧化，2）β位的水合，3）β位的氧化，4）裂解，被階段性分解為2個碳原子的短鏈脂肪酸和作為ATP原料的乙酰CoA。其中生成的2個碳原子的短鏈脂肪酸再通過同一個循環(huán)，以2ⁿ個碳原子的短鏈脂肪酸重復分解。

研究提出，癌癥以及非酒精性肝炎（NASH）等疾病中，脂肪酸β-氧化會出現(xiàn)很大的變動，因此開發(fā)檢測脂肪酸β-氧化活性的方法備受期待。然而，在活細胞中檢測多種酶參與的脂肪酸β-氧化一直以來都十分困難。

FAOBlue是一款新型脂肪酸β-氧化應答型熒光探針，由九州大學研究生院藥學研究院、專攻藥物發(fā)現(xiàn)化學生物學領(lǐng)域的王子田彰夫教授開發(fā)。只需將產(chǎn)品添加到培養(yǎng)基中的簡單操作，便可以通過熒光觀察定量脂肪酸β-氧化活性。

◆原理

FAOBlue是一種在碳原子數(shù)為9的壬酸的碳鏈末端添加了藍色熒光色素xiangdousu衍生物的化合物，此外，通過用乙酰氧基甲基酯保護末端脂肪酸來提高細胞膜透過性。雖然FAOBlue中含有xiangdousu衍生物，但是在該狀態(tài)下，它不會在405 nm激發(fā)下發(fā)出熒光。

1. 附著在羧基的乙酰氧甲基具有高疏水性，因此FAOBlue可以跨越細胞膜，有效地攝入到細胞中。

2. 通過細胞內(nèi)的酯水解酶去除乙酰氧基甲酯，轉(zhuǎn)換成游離脂肪酸的形態(tài)。

3. 通過脂酰CoA合成酶轉(zhuǎn)換成脂酰CoA，攝入β-氧化途徑。

4. 通過β-氧化循環(huán)壬酸（C9）按庚酸（C7）、戊酸（C5）、丙酸（C3）的順序轉(zhuǎn)換，在第四次β-氧化循環(huán)的丙酸

4. 被分解時，xiangdousu衍生物被釋放出來。xiangdousu衍生物在405 nm激發(fā)下發(fā)出藍色熒光。

5. 由于游離的xiangdousu衍生物擴散到整個細胞中，因此通過檢測細胞內(nèi)的藍色熒光強度，可以實時且定量的評價β-氧

4. 化活性。

※　通過添加肉堿穿梭抑制劑的Etomoxir，有效地抑制了細胞內(nèi)的熒光上升。

※　該結(jié)果證明FAOBlue主要檢測線粒體的FAO活性。

◆特點

●　FAOBlue處于消光狀態(tài)，分解后的游離xiangdousu衍生物呈現(xiàn)出比分解前更高的熒光強度。

●　添加培養(yǎng)基后，30 min~120 min后便可觀察。

●　無需特別操作即可檢測β-氧化活性。

●　實例驗證能觀察多種細胞類型的β-氧化。

●　有抑制藥物依賴性β-氧化和因促進而引起的活性變化的成功檢測案例。

●　檢測波長：激發(fā)405 nm/熒光460 nm。

※　注意：

使用共聚焦激光顯微鏡時，推薦使用405 nm激光激發(fā)。如果本試劑在330～380 nm的范圍內(nèi)激發(fā)的話，會觀察到無關(guān)FAO活性的370～450 nm（最大熒光波長410 nm）的熒光。使用熒光顯微鏡時，為了特異性觀察FAO活性，推薦選擇激發(fā)波長在390～430 nm范圍內(nèi)的激發(fā)光濾光片。詳情請參考數(shù)據(jù)實例：FAO特異性吸收光譜、熒光光譜的變化。

◆原著論文

Uchinomiya et. al., Chem. Commun. 56, 3023～3026 (2020) .

"Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Pathway in Living Cells."

◆應用

●　評價各種細胞的β-氧化活性

●　β-氧化相關(guān)的基因基礎研究

●　抑制或促進β-氧化的化合物的探索  等

◆操作方法概況

1. 在HBS中溶解FAOBlue至終濃度為5~20 μM^*1。

1. *1  針對不同的細胞類型，合適的濃度有所差異。建議根據(jù)具體實驗進行探討。

2. 去除培養(yǎng)基，用HBS清洗細胞2次。

3. 向細胞添加含有FAOBlue的HBS。

4. 在37°C下培養(yǎng)30 min以上^*2。

1. *2  針對不同的細胞類型，合適的培養(yǎng)時長有所差異。建議根據(jù)具體實驗進行探討。

5. 更換培養(yǎng)基后^*3，通過成像觀察藍色熒光（Ex. 405 nm/Em. 430～480 nm）。

1. *3  染色后的培養(yǎng)基更換是非必須的。即使不清洗也可進行觀察。

實驗注意點

由于本試劑使用405 nm的激發(fā)光，根據(jù)不同的觀察對象，可能會觀察到其自發(fā)的熒光。建議同時進行未添加本試劑的陰性對照實驗。尤其是在顯微鏡下觀察到點狀熒光信號時，可能就是細胞的自發(fā)熒光。

◆應用實例

FAO特異性吸收光譜、熒光光譜的變化

FAOBlue以及xiangdousu衍生物的吸收光譜（左）和熒光光譜（右）。

FAOBlue在通過FAO轉(zhuǎn)換成xiangdousu衍生物后，吸收最大值由350 nm變?yōu)?05 nm的長波長。因此，在405 nm的激發(fā)條件下，F(xiàn)AOBlue不會發(fā)出熒光，只有在通過FAO釋放xiangdousu衍生物時才會發(fā)出藍色熒光。

※　注意：

若使用處于FAOBlue的吸收最大值350 nm左右的光激發(fā)，F(xiàn)AOBlue也會發(fā)出藍色熒光（380～450 nm；最大波長400 nm）。若在熒光顯微鏡中使用普通的DAPI濾光片，將會同時激發(fā)未反應的FAOBlue以及FAO反應后的xiangdousu衍生物。所以在選擇濾光片時請格外注意。

可視化各種細胞類型中的FAO活性

在4種癌細胞中加入FAOBlue，培養(yǎng)一定時間后進行熒光觀察。所有細胞都觀察到了藍色熒光，而添加FAO抑制劑etomoxir后熒光顯著衰減，由此可知，藍色熒光是由FAO活性引起的。

※ 各種細胞的實驗條件有所不同。

※ HepG2 : 5 μM, 30 min

※ LNCaP: 20 μM, 120 min

※ HeLa : 20 μM, 120 min

※ A549 : 5 μM, 30 min

觀察刺激依賴性β-氧化的變化

向HepG2細胞添加脂質(zhì)代謝促進劑AICAR^*2（200 μM，3 h）或部分FAO抑制劑ranolazine（200 μM，12 h）進行前處理后，添加FAOBlue（5 μM）培養(yǎng)30 min。進行熒光觀察時，可以看到對比對照實驗（未處理），AICAR中熒光強度明顯增強，ranolazine中熒光強度明顯降低。

＊2  AICAR : AMPK（AMP-activated protein kinase）活化劑具有活化脂質(zhì)代謝的功能。

藥物作用的定量分析

使用FAOBlue可以定量分析藥物對FAO的效果。用非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）的候選治療藥ND-630（acetyl-CoA carboxylase inhibitor）前處理HepG2細胞4 h后，添加FAOBlue（5 μM）培養(yǎng)30 min。使用共聚焦激光顯微鏡評價藍色熒光強度時，可以觀察到依賴于ND-630濃度的熒光強度增加。由此可知，ND-630增強了FAO的活性。

NASH模型小鼠分析

非酒精性肝炎（NASH）是一種與脂質(zhì)相關(guān)的疾病，已知會降低脂肪分解的速度。向正常小鼠和NASH模型小鼠以口服形式給藥增強脂質(zhì)代謝的bezafibrate后，回收其肝臟制備初代培養(yǎng)肝細胞。向各個細胞加入FAOBlue（5 μM）觀察其FAO活性，結(jié)果顯示，對比正常小鼠來源細胞，NASH模型小鼠來源細胞的FAO活性明顯被抑制。另一方面，我們可以看到給藥bezafibrate的NASH模型小鼠來源細胞中FAO恢復了活性。

本試劑可用于脂質(zhì)相關(guān)疾病模型中的FAO定量分析。

※ 本頁面產(chǎn)品僅供研究用，研究以外不可使用。